15. IDENTIFICANDO BASTONETES GRAM-NEGATIVOS

Salmonella spp. em ágar CLED e ágar MacConkey após 24 horas de incubação à 36ºC.
Nos dois meios de cultura observamos ausência de fermentação da lactose.
Fonte: Autora (arquivo pessoal)

IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM-NEGATIVOS

(Enterobactérias e Pseudomonas aeruginosa)

(Microbiologia Básica / Profa . Zilka Nanes Lima)

Número da amostra ( )

1.      Descreva a morfologia das colônias em ágar CLED, ágar MacConkey e ágar EMB:

   1. a) Descreva as características morfológicas das colônias bacterianas isoladas em ágar CLED.

Tamanho: ________________________ Cor: _______________________________
Borda ou forma:___________________ Densidade: _____________________________

Elevação:_________________________ Consistência: ___________________________

Odor: ___________________________ Hemólise (em ágar Sangue):________________

1. b) Descreva as características morfológicas das colônias bacterianas isoladas em ágar MacConkey e ágar EMB.

Tamanho: ________________________ Cor: ________________________________

Borda ou forma:___________________ Densidade: ___________________________

Elevação:_________________________ Consistência: _________________________

Odor: ___________________________

1.c) Observando estas características morfológicas, qual(is) é (são) a(s) sua(s) suspeita(s) ?

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2.Realize o Gram de uma ou poucas colônias deste micro-organismo, depois descreva observando à microscopia (x1.000 - imersão) a forma, o arranjo (se houver) e a afinidade pelo corante. [Obs: Se bastonetes relatar se são curtos (alguns aparentando cocobacilos), médios ou longos.]:

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3. Identifique o(s) micro-organismo(s) isolado através de testes bioquímicos tradicionais, baseando-se também nas características morfológicas das colônias em ágar MacConkey. Utilize as tabelas de +/- de identificação de enterobactérias. De acordo com a sua suspeita direcione a análise para a(s) tribo(s). Caso não consiga concluir a identificação apenas pela tabela anterior, prove a identificação através do desempate das probabilidades na tabela de percentagens. (Em anexo)

Os meios de cultura que serão utilizados serão: Citrato / TSI / LIA / FEN / Hid. da uréia / SIM / MIO / Caldo Malonato / 2 tubos de caldo MR-VP

Depois de identificar a bactéria coloque ao lado de cada teste a percentagem de positividade da bactéria que você identificou:

Catalase ( + ) 100% Lisina descarboxilase:( ) ____

Oxidase ( - ) 0 % Ornitina: ( ) ____

Indol: ( ) ____ Malonato: ( ) ____

VM: ( ) ____ Motilidade/ 36^oC : ( ) ____

VP: ( ) ____ D-glicose (ácido): ( ) ____

Citrato: ( ) ____ D-glicose (gás/CO₂): ( ) ____

Sulfeto de hidrogênio (H₂S): ( ) ____ Lactose: ( ) ____

Hidrólise da uréia: ( ) ____ Sacarose: ( ) ____

Fenilalanina: ( ) ____ DNAse/ 25^oC : ( ) ____

Teste Complementar: Lisina desaminase: ( ) Não precisa pesquisar percentagem de positividade

Bactéria : ____________________________________________

4. Use o sistema numérico para tentar identificar as enterobactérias (Não identifica Bastonetes Gram-negativos não´fermentadores de glicose):

(EPM/ Mili/ Citrato + lactose da placa de ágar MacConkey):

Lactose = Uréia= Indol=

Gás= LTD= Lisina=

H₂S= Motilidade= Citrato=

____________________________________________________________

Número encontrado:________

A bactéria foi identificada como:_________________________________________

(Nem sempre o sistema numérico identifica a bactéria de maneira correta, por isso confirme através dos testes bioquímicos tradicionais o resultado obtido acima)

SOBRE O SISTEMA NUMÉRICO PARA IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTÉRIAS:

As 8 reações bioquímicas (lactose, gás, H₂S, urease, desaminação do L-triptofano (fenilalanina), motilidade, indol, lisina descarboxilase e citrato) somadas ao da fermentação da lactose na placa de isolamento foram agrupadas em 3 conjuntos de provas. A soma de cada um destes conjuntos produz um algarismo, de modo que o resultado produz um número de 3 dígitos, que identifica uma espécie bacteriana. Os 3 conjuntos de provas e seus valores são:

PRIMEIRO ALGARISMO (A) SEGUNDO ALGARISMO (B) TERCEIRO ALGARISMO (C)

Lactose (4) Urease (4) Indol (4)

Gás (2) LTD (2) Lisina (2)

H₂S (1) MOT (1) Citrato (1)

Observações:

1) Quando a reação da cepa investigada é positiva (+), colocamos o número correspondente.

Exemplos: Urease + = 4, Lisina + = 2. Se a reação é negativa (-), colocamos para a mesma o valor 0(zero).

2) Em seguida somamos os valores obtidos em cada série. O valor de A indica o primeiro algarismo, o valor de B o segundo e o valor de C o terceiro algarismo.

Por exemplo, uma cepa que apresente o seguinte resultado bioquímico:

Lactose - 0 Urease + 4 Indol - 0

Gás - 0 LTD + 2 Lisina - 0

H2S + 1 MOT + 1 Citrato + 1

______________________________________________________

1 7 1

terá o número 171 que corresponde na relação à bactéria Proteus mirabilis.

* Conferir na tabela de percentagem de enterobactérias (elaborada pela Professora Zilka usando o livro de Koneman como referência) se todos os resultados dos testes bioquímicos baterm com o encontrado pelo Sistema Numérico. (INFORMAÇÃO PESSOAL)

4) Quando no número encontrado existir mais de uma espécie bacteriana, deverão ser realizadas provas bioquímicas complementares.

5) Também deverão ser usadas provas complementares quando o resultado obtido corresponde a um número não existente na tabela.

NÚMERO ESPÉCIE BACTERIANA

000 Shigella sonnei - Yersinia pestis - Shigella spp

004 Shigella spp - Yersinia enterocolitica - Escherichia coli

006 Escherichia coli

011 Citrobacter freundii

012 Hafnia alvei

013 Serratia marcescens - Hafnia alvei

014 Escherichia coli

015 Citrobacter diversus

016 Escherichia coli

035 Providencia stuartii - Providencia alcalifaciens

040 Yersinia pseudotuberculosis - Yersinia enterocolitica

044 Yersinia enterocolitica

051 Citrobacter freundii

053 Serratia marcescens

055 Citrobacter diversus

070 Proteus penneri

074 Morganella morganii subsp.morganii

075 Providencia stuartii - Providencia rettgerii

111 Citrobacter freundii

112 Salmonella Typhi

113 Salmonella spp.

151 Citrobacter freundii

170 Proteus mirabilis - Proteus penneri

171 Proteus mirabilis

174 Proteus vulgaris

175 Proteus vulgaris

202 Hafnia alvei

204 Escherichia coli

206 Escherichia coli

210 Salmonella Paratyphi A - Serratia liquefaciens

211 Citrobacter freundii - Serratia liquefaciens

212 Hafnia alvei - Salmonella Choleraesuis - Serratia liquefaciens

213 Serratia marcescens - Salmonella Choleraesuis - Serratia liquefaciens

214 Escherichia coli

215 Citrobacter diversus

216 Escherichia coli

235 Providencia alcalifaciens

251 Citrobacter freundii

253 Serratia marcescens

255 Citrobacter diversus

270 Proteus penneri

274 Morganella morganii

310 Salmonella Paratyphi A

311 Citrobacter freundii

312 Salmonella Choleraesuis

313 Salmonella Choleraesuis - Salmonella spp

316 Edwardsiella tarda

351 Citrobacter freundii

370 Proteus mirabilis - Proteus penneri

371 Proteus mirabilis

374 Proteus vulgaris

375 Proteus vulgaris

404 Escherichia coli

406 Escherichia coli

410 Serratia liquefaciens

411 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae - Serratia spp.

412 Serratia liquefaciens

413 Serratia spp.

414 Escherichia coli

415 Citrobacter diversus

416 Escherichia coli

417 Serratia odorifera

443 Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae

447 Klebsiella oxytoca

451 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae

455 Citrobacter diversus

511 Citrobacter freundii

551 Citrobacter freundii

604 Escherichia coli

606 Escherichia coli

607 Klebsiella oxytoca

610 Serratia liquefaciens

611 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae - Serratia sp

612 Serratia liquefaciens

613 Enterobacter aerogenes - Serratia spp.

614 Escherichia coli

615 Citrobacter diversus

616 Escherichia coli

643 Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae

647 Klebsiella oxytoca

651 Citrobacter freundii - Enterobacter cloacae

655 Citrobacter diversus

711 Citrobacter freundii

751 Citrobacter freundii

5. Caso a bactéria tenha sido identificada como Pseudomonas aeruginosa (ou outro bastonete Gram-negativo que não seja enterobactéria), anote quais foram as características observadas para chegar a esta conclusão, além dos resultados que queira complementar. [*É que se espera]

- Lactose em ágar MacConkey/ ágar EMB:( ___________) *Negativa

- Crescem em ágar MC à 42ºC (_____________) * Crescem

- Hemólise em ágar Sangue (_______________) *Beta-hemolisina

- Citocromo-oxidase (_____________) *Positiva – reação rápida em até 10 segundos

- Fermentação da glicose em TSI (____________) *Não fermentador da glicose

- Motilidade no SIM (_______) *Presente (bactéria uniflagelar)

- Lisina descarboxilase (____________) *Negativa

- Sensibilidade à Polimixina B (halo ≥12 mm = Sens.) (_________) *Sensível

- Odor característico (____________) *de aminas (uva ou “sabonete de rodoviária)

- Produção de pigmento (__________________) *Em geral pigmento verde (piocianina)

- PYR (___________) * Variável – Prova complementar

- Esculina (___________) *Negativa – Prova complementar

Referências:

- Oplustil, C.P.; Zoccoli, C.M.; Tobouti, N.R.; Sinto, S.I. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica, 3ª Edição. Ed. Sarvier, São Paulo, SP, 2010.

-Enterokit B (Probac do Brasil/ Declaro que não tenho conflito de interesses). http://www.masterdiagnostica.com.br/produto/enterokit-b Acesso em 27 de Setembro de 2016.

Copyright ZILKA NANES LIMA © 2016

Direito exclusivo da autora de imprimir, reproduzir ou vender obra literária, artística ou científica.

FOTOS DA AULA PRÁTICA (PARTE 1):

IDENTIFICAÇÃO DE BASTONETES GRAM-NEGATIVOS

DATA DA AULA PRÁTICA: 29 de Setembro de 2016.

Declaro que não tenho conflito de interesses (Professora Zilka Nanes)

Bactéria 01 - Família Pseudomonadaceae
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) - Não é uma enterobactéria
(Bastonetes Gram-negativos, Não fermentador de glicose, citocromo oxidase positiva)

Bactéria 02 - Família Enterobacteriaceae
No sistema numérico - 616 - Escherichia coli (ATCC 25922)
(Bastonetes Gram-negativos, fermentador de glicose, citocromo oxidase negativa)

Bactéria 02: Escherichia coli

Bactéria 03 - Família Enterobacteriaceae
No sistema numérico-643- Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae (ATCC 700 603)
(Bastonetes Gram-negativos, fermentador de glicose, citocromo oxidase negativa)

Bactéria: Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae

Bactéria 04 - Família Enterobacteriaceae
No sistema numérico - 370 - Proteus mirabilis - Proteus penneri (isolado clínico de urina)
(Bastonetes Gram-negativos, fermentador de glicose, citocromo oxidase negativa)

Bactéria: Proteus mirabilis

Bactéria 05 - Família Enterobacteriaceae
No sistema numérico - 213 - Serratia marcescens - Salmonella Choleraesuis - Serratia liquefaciens
(*Pesquisar qual dessas bactérias produz pigmento rosa)

(Bastonetes Gram-negativos, fermentador de glicose, citocromo oxidase negativa)

Bactéria: Serratia marcescens

Bactéria 06 - Família Enterobacteriaceae
No sistema numérico - 374 - Proteus vulgaris (isolado clínico de urina)
O teste da Ornitina-descarboxilase é Positiva sendo a bactéria 06 identificada como Morganella morganiii subsp. morganii
(Bastonetes Gram-negativos, fermentador de glicose, citocromo oxidase negativa)

Bactéria: Morganella morganii
Pelo sistema numérico; Proteus vulgaris

Texto do e-mail enviado para turma 2016.1 de Microbiologia Básica no dia 30/09/16.

Sobre a Atividade Prática de Identificação de Bastonetes Gram-negativos e Sistema Numérico para Identificação de Enterobactérias, fecho a explicação na aula teórica da próxima quinta-feira (06/10/2016).

Os números que vocês encontraram utilizando o Sistema Numérico, e me mostraram o resultado escrito, ontem (30/09/16) durante a aula são os que seguem:

Bactéria 03 - 643 - Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae

Bactéria 04 - 371 - Proteus mirabilis Errata: 370 - Proteus mirabilis - Proteus penneri

Bactéria 05 - 213 - Serratia marcescens - Salmonella Choleraesuis - Serratia liquefaciens (Pesquisar qual destas bactérias produz pigmento rosa.)

Bactéria 06 - 374 - Proteus vulgaris

Se o Sistema Numérico aponta somente um gênero-espécie, a probabilidade de ser essa enterobactéria é alta (bactérias 03, 04 e 06).

Números que indicam mais de um gênero-espécie, precisamos encontrar características extras para concluir a identificação (como é o caso da bactéria 05).

O Sistema Numérico funciona bem, mas infelizmente tem vezes que existe falha pois estamos trabalhando com seres vivos metabolicamente ativos que não necessariamente expressam concomitantemene todas as características que lhe são peculiares. Nessas bactérias que utilizei na aula prática, ele identifica a bactéria 06 com Proteus vulgaris, quando conferimos os outros testes notamos que Proteus vulgaris não tem Ornitina-descarboxilase positiva; a identificação seria Morganella morganii subsp. morganii

O Sistema Numérico acerta a identificação das bactérias 03 e 04.

Bom. Na próxima aula (06/10/16) acaberemos de preencher (e entender) esta atividade prática.

Abraços.

Professora Zilka Nanes Lima

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Comentários

Unknown11/28/2021
como faço pra achar as outras bactérias ? só vai até a 06, queria achar pelo menos a 012 ( hafnia )????????
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