6. TÉCNICAS DE SEMEADURA

Fonte: http://www.prolab.com.br/

Técnicas de semeadura por esgotamento e da alça calibrada. Análise da morfologia de colônias isoladas de micro-organismos em meios sólidos.

(Microbiologia Básica / Profa . ZilkaNanes Lima)

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1.   Técnica de semeadura por esgotamento

     a) Primeiro marcar o fundo da placa que vai ser processada com o protocolo ou nome do paciente, origem da amostra e data. 

b) Posteriormente fazer o inóculo em um dos cantos da superfície do meio de cultura; ou com swab com a amostra biológica recém coletada (quando a secreção estiver nele) ou transferir uma alíquota com alça bacteriológica (em caso de amostras biológicas que não são coletadas com swab, como as fezes; ou ainda quando se faz repique de culturas guardadas em geladeira em meios sólidos ou caldos); rolar o swab no mesmo lugar do meio algumas vezes. Descartar o swab em solução de hipoclorito de sódio à 0,5% ou em lixo hospitalar. As secreções podem ser colocadas em ágar Stuart, que é um meio de transporte, para preservar as características por mais tempo até o processamento. Quando utilizar Stuart, retornar o swab para o tubo e deixar à temperatura ambiente, assim a amostra ficará estável por 24 horas.

 c) Flambar a alça bacteriológica, deixar esfriar. Tocar encima do inóculo feito com o swab espalhando o mesmo com a alça fazendo estrias bem juntas em cerca de um terço da superfície  da placa, de modo gradativo vai se fazendo outras estrias mais afastadas uma das outras em novas direções até esgotar o material contido no inóculo. Preferencialmente usa-se um esquema de divisão da placa em 4 quadrantes sendo que a estria de cada quadrante toca no final da estria do quadrante anterior arrastando bactérias deste último. Nesse caso, deve-se flambar a alça após a inoculação de cada quadrante. Pode-se também optar por não tocar no final da estria do quadrante anterior, não sendo assim necessário flambar a alça após cada quadrante. A estria do último quadrante ocupa a maior parte da placa. Alternativamente pode-se fazer 3 estrias, a primeira ocupando metade da placa e as outras duas um quarto da placa cada. Neste modo as estrias não se tocam. Caso o meio do processamento seja o ágar Sangue, após fazer as estrias, furar o meio de cultura encima das estrias até o fundo da placa com a alça bacteriológica na posição vertical. 
‡           d) Incubar a placa invertida em estufa bacteriológica à 36 ± 2 ^oC por 24 horas. Após cerca de 24 horas avaliar as características morfológicas das colônias isoladas. O ágar Sangue deve ser incubado em microaerofilia na mesma temperatura, colocar as placas dentro de um jarra de vidro ou lata, acender uma vela, deixar acessa dentro da jarra e fechá-la; a vela irá consumir boa parte do oxigênio e gerar o aumento de dióxido de carbono.

       Figura 1 - Esquema para semeadura de meios de cultura pela técnica do esgotamento.

Fonte: Autora (arquivo pessoal)

 Objetivos da técnica de esgotamento:

A técnica de semeadura por esgotamento é utilizada para obtenção de colônias isoladas em meio sólido. O material a ser processado pode ser o micro-organismo em caldo ou em ágar ou amostras clínicas tais como secreções. A técnica visa obter colônias isoladas de bactérias ou leveduras presentes em materiais biológicos, permitindo a diferenciação de diferentes tipos morfológicos.

A técnica do esgotamento em placa consiste em depor sobre um ponto da superfície do meio uma alíquota do material e depois espalhá-lo em três ou quatro setores, por meio de alça de platina, sem recarregá-la, de maneira a obter quantidades progressivamente menores do material. Temos que obter rarefação suficiente do material, de modo a formar colônias perfeitamente isoladas.

O sucesso da semeadura está em:

 a) grande número de estrias;

 b) não perfurar o meio;

 c) não voltar a alça sobre a estria

 d) pegar pequena quantidade de material para semear. 

 e) SEMPRE TRABALHAR COM TODO MATERIAL PRÓXIMO À CHAMA DO BICO           DE BUNSEN PARA EVITAR CONTAMINAÇÃO EXTERNA NO SEU EXPERIMENTO.

 f) SEMPRE FLAMBAR A ALÇA BACTERIOLÓGICA QUANDO NECESSÁRIO.

 g)DESCARTAR SWABS CONTAMINADOS EM SOLUÇÃO DE HIPOCLORITO DE           SÓDIO À 0,5 %. 

                  Figura 2 - Colônias de Staphylococcus spp. em ágar Müeller Hinton, coletadas com 
        swab umedecido  em solução fisiológica da parte de trás do pavilhão auricular direito.  

Fonte: Autora (arquivo pessoal)

2. Técnica da alça calibrada

         a) Homogeneizar a amostra de urina (Primeira micção - jato médio), ou qualquer outra amostra líquida que se queira quantificar os micro-organismos. Não centrifugar.

       b) Imergir a alça calibrada de 0,001 mL (1 µL) na urina de forma vertical, ou alça de 0,01mL (10 µL) em outras amostras. Observar se preencheu todo o espaço do aro com urina. Observar se não ficou bolhas no líquido que preenche o aro.

        c) Semear primeiro em placa de ágar CLED (não seletivo), imergir novamente a alça na urina e em seguida semear a placa de ágar MacConkey (seletivo) / Em caso de urina de gestante adicionar uma placa de ágar Sangue e semear primeiro este meio, não esquecer de fazer as picadas com alça para evidenciar hemólise. 

         d) Incubação: em estufa à 35 ±1 oC por 18 a 24 horas.

As placas de ágar CLED ou ágar MacConkey deverão ser incubadas em estufa bacteriológica ambiente por 24 horas (e ágar sangue em microaerofilia), devendo este período ser prolongado quando NÃO HOUVER CRESCIMENTO NO PRIMEIRO DIA DE INCUBAÇÃO, e as condições clínicas justificarem ou quando houver suspeita de infecção por Gram-positivos (Enterococcus spp, Streptococcus agalactiae ou leveduras). O tempo de incubação também deverá ser prolongado para 48 - 72 horas se na análise da sedimentoscopia da urina foi observada a presença de freqüentes micro-organismos ou número elevado de leucócitos e se o resultado da bacterioscopia sugere infecção urinária. Em urinas de pacientes hospitalizados havendo suspeita de ITU deixar as placas incubadas por até 5 dias, principalmente o ágar MacConkey, pois a Stenotrophomonas maltophilia pode crescer somente após este tempo.

                        Figura 3 - Esquema para semeadura de meios de cultura pela técnica da                                                      alça calibrada (técnica quantitativa)

Fonte: Autora (arquivo pessoal)

                                          Figura 4 - Técnica da alça calibrada (quantitativa) 
                               54.000 colônias por mL de Candida parapsilosis em ágar CLED. 
                                                             (CLED = cystine lactose eletrolyte deficient) 

Fonte: Autora (arquivo pessoal)

                      Interpretação: Alça de 1 microlitro - 1 colônia = 1.000 ou 10³ UFC/mL

                                               alça de 10 microlitros - 1 colônia = 100 ou 10² UFC/mL

Explicação da técnica: Em sua execução a alça bacteriológica é introduzida em uma amostra de urina bem homogeneizada, fazendo-se movimentos para baixo e para cima no sentido vertical. A alça carregada é então utilizada para inocular cada meio de cultura, fazendo-se, inicialmente, uma linha reta no centro da placa e completando-se o espalhamento com uma série de passagens em um ângulo de 90º, através da linha original. Importante item de controle de qualidade é utilizar alças calibradas periodicamente aferidas ou, quando possível, alças descartáveis.

Objetivos da técnica da alça calibrada: Quantificar micro-organismos em amostras líquidas. Isolar colônias de micro-organismos permitindo assim a descrição da sua morfologia.

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3.Análise morfológica da colônia (Utilizar os espaços que seguem para anotar a interpretação destas características e ao final sugerir o possível gênero e/ou espécie do micro-organismo).

Meio de cultura: _______________________ Densidade: _________________________

Tamanho/Odor: _______________________ Cor: _______________________________

Borda ou forma:_______________________  Consistência/Aparência: _______________

Elevação:____________________________ Hemólise em ágar Sangue: _____________

Sugerir qual é o micro-organismo: ___________________________________________

Tabela 1. Características do crescimento de alguns micro-organismos.

Micro-organismo	Tamanho / Odor	Borda ou forma	Elevação	Densidade	Cor	Consistência/ Aparência	Hemólise em AS
Staphylococcus aureus	Grande /Queijo	Circular	Convexa	Opaca	Amarela ou branca	Cremosa	Em geral beta
Staphylococcus coagulase-negativa	Médio /Queijo	Circular	Elevada	Opaca	Branco-acizentada	Cremosa	Em geral sem
Streptococcus do grupo viridans	Pequeno /Caramelo	Irregular, puntiforme	Achatada	Opaca	Branco-acizentada	Embaçada	Alfa
Streptococcus pneumoniae	Pequeno	Circular	Umbilicada Achatada	Transparente	Cinza	Brilhante Mucóide	Alfa
Streptococcus pyogenes	Pequeno	Puntiforme	Convexa	Translúcida	Cinza	Brilhante	Beta
Streptococcus agalactiae	Médio	Circular	Convexa	Translúcida	Cinza	Cremosa	Beta
Enterococcus faecalis	Médio /Caramelo	Circular	Elevada	Opaca	Cinza	Brilhante	Em geral sem
Escherichia coli	Médio /Vinagre	Circular	Achatada	Opaca	Cinza (AS) Rosa(MC)	Seca	Em geral beta
Klebsiella spp.	Grande /Fermento de pão	Circular	Convexa	Opaca	Cinza(AS) Rosa(MC)	Mucóide	Sem hemólise
Salmonella spp.	Pequeno /Fétido	Circular	Convexa	Translúcida	Centro preto(SS) Incolor(MC)	Brilhante	Sem hemólise
Proteus spp.	Médio /Fétido	Ondulada	Achatada	Translúcida	Incolor (MC)	Brilhante	Sem hemólise
Pseudomonas aeruginosa	Médio /Uva	Irregular	Achatada	Transparente	Incolor (MC). Pigmento esverdeado.	Brilhante	Com ou sem.
Candida spp.	Médio /Pão	Circular, filamentosa	Elevada	Opaca	Branca	Cremosa	Sem

AS= Agar sangue; MC=Agar MacConkey; SS= Agar Salmonella-Shigella;

Tamanho das colônias (mm) : Grande = maior que 1 mm de diâmetro (Ex: Klebsiella pneumoniae)

                                    Média = 1 mm de diâmetro (Ex: Enterococcus faecalis)

                                    Pequena = menor que 1 mm de diâmentro (Ex: Streptococcus pyogenes)

Referências bibliográficas:

- Oplustil, C.P.; Zoccoli, C.M.; Tobouti, N.R.; Sinto, S.I. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica, 3ª Ed. Sarvier, São Paulo, SP, 2010.

- http://coral.ufsm.br/microgeral/Praticas/Roteito%20pratica%20semeaduras.pdf Acessado em 03 de Julho de 2013.

- Conhecimento adquirido

                                                                              Professora Zilka Nanes Lima    (Professora de Microbiologia e Imunologia Clínica)

                              

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