10. CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO

Fonte: www.bioneogenios.blogspot.com.br/

CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO

                                (Microbiologia Básica / Profa . Zilka Nanes Lima)

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1. INTRODUÇÃO:

As bactérias reproduzem-se por fissão binária (figura 1), processo em que uma célula parental divide-se, originando duas células-filhas. Pelo fato de uma célula originar duas células-filhas, é referido que as bactérias realizam crescimento exponencial (crescimento logarítimico). O conceito de crescimento exponencial pode ser ilustrado pela seguinte relação:

Número de células:  1     2    4     8     16    32   64    128  256

          Exponencial:  2⁰    2¹   2²    2³    2⁴     2⁵    2⁶    2⁷    2⁸

Assim, uma célula bacteriana produzirá 16 novas células após 4 gerações; e 256 novas células após 8 gerações.

               Figura 1 - Bactérias se dividem por fissão binária ou cissiparidade.

Fonte:Bersek

O tempo de duplicação (geração) das bactérias varia de somente 20 minutos , no caso de Escherichia coli, a mais de 24 horas, no caso de Mycobacterium tuberculosis. O crescimento exponencial e o tempo curto de duplicação de alguns organismos resultam na rápida geração de grande número de bactérias. Por exemplo, um organismo de E. coli originará uma progênie superior a 1000 em aproximadamente três horas, e acima de um milhão em cerca de sete horas. O tempo de duplicação varia não somente em relação à espécie, mas também de acordo com a quantidade de nutrientes, temperatura, pH e outros fatores ambientais.

O ciclo de crescimento de bactérias apresenta quatro fases principais. Se um pequeno número de bactérias for inoculado em um meio nutriente líquido, realizando-se contagem de bactérias a intervalos frequentes, as fases típicas de uma curva de crescimento padrão podem ser demonstradas (figura 2):

(1)   FASE lag : A primeira corresponde a fase lag, durante a qual ocorre intensa atividade metabólica; contudo, as células não se dividem. Essa fase pode durar de alguns minutos a muitas horas.

(2)   FASE log (logarítmica) : Nesta fase se observa rápida divisão celular. Fármacos β-lactâmicos, como as penicilinas, atuam durante esta fase, uma vez que os fármacos são eficazes no período em que as células estão produzindo peptidioglicano, isto é, quando estão em divisão.

(3)   FASE ESTACIONÁRIA : Ocorre quando a depleção de nutrientes ou os produtos tóxicos provocam uma diminuição no crescimento até que o número de células novas produzidas equilibra-se com o número de de células que morrem, resultando em um steady state (estado de equilíbrio). As células cultivadas em um aparato especial , denominado “quimiostato”, no qual nutrientes frescos são adicionados e produtos de excreção são removidos continuamente, podem permanecer na fase log e não entram em fase estacionária.

(4)   FASE DE MORTE : Corresponde à fase final, caracterizando-se por um declínio no número de células bacterianas viáveis.

              Figura 2 - Fases da curva de crescimento bacteriano

Fonte: http://slideplayer.com.br/slide/361163/

2. MÉTODOS PARA SE REALIZAR A CURVA DE CRESCIMENTO:

2.1 PRÁTICA 1 – Inoculação direta à partir de meio de enriquecimento. 
                         - Em dois dias de aula prática.

ATENÇÃO: ESTE PRIMEIRO MÉTODO NÃO DEVE SER UTILIZADO PARA PESQUISA. ELE FOI ELABORADO PELA PROFESSORA ZILKA NANES APENAS PARA ENTENDIMENTO DOS ALUNOS DE MICROBIOLOGIA BÁSICA SOBRE A CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO. CASO DESEJE UM MÉTODO REPRODUZÍVEL, UTILIZE O MÉTODO 2 - Verificação por turbidez no espectrofotômetro.

                  2.1.1 MATERIAL NECESSÁRIO:

• Erlenmeyer de 250 mL * (para preparar o caldo BHI)

• Meio de enriquecimento líquido* (BHI)

• 06 placas de Petri (90x20 mm) com ágar BAB

• Palito de dente ou swab*; ou alça bacteriológica

• Solução fisiológica *

• Alça de Drigalski (ou de vidro ou descartável)

• Tubos de vidro com tampa baquelite*

• Pipetas de vidro de 5 mL

• Escherichia coli em meio de cultura sólido

• Ponteiras amarelas* e pipetas analíticas

OBS: * esse material deve ser estéril

2.1.2 PROCEDIMENTOS:

                Inoculação direta à partir de meio de enriquecimento. 

No primeiro dia de aula prática:

       No dia anterior - Preparar o meio BHI líquido e o autoclavar. Colocar cerca de 5 mL do meio em um tubo de vidro. Com um palito de dente, raspar um POUCO da cultura de E. coli na placa de Petri e encostar no meio de cultura (pré-inóculo). Deixar crescer esse pré-inóculo de um dia para o outro à temperatura a ser testada, sempre em agitação. (No primeiro dia de aula  o caldo BHI já estará inoculado e incubado por 24 horas à 36ºC – pré-inóculo).

A) Para um novo tubo com 5 mL de caldo BHI, transferir 10 µL do pré-inóculo. Marcar o tempo inicial em um cronômetro.  Homogeneizar o caldo BHI, e com outra ponteira retirar 10 µL e depositar na superfície do ágar BAB; flambar a alça de Drigalski e deixar esfriar; posteriormente espalhar todo o inóculo com a alça de Drigalski até este ser absorvido pelo meio. Marcar a placa como tempo ZERO, e incubá-la em estufa bacteriológica à 36ºC. Incubar o caldo BHI em estufa bacteriológica até completar 26 minutos.

B) Após este tempo, preparar o material necessário para o próximo processamento (ágar BAB, alça de Drigalski, pipetas analíticas e ponteiras). Quando completar 1 hora de incubação pegar o caldo BHI e repetir o procedimento anterior [retirar 10 µL e depositar na superfície do ágar BAB...], marcando agora esta placa como tempo TRINTA MINUTOS, e incubá-la em estufa bacteriológica à 36ºC.  Incubar o caldo BHI novamente em estufa bacteriológica por mais tempo até completar 55 minutos.

C) Após este tempo, preparar o material necessário para o próximo processamento (ágar BAB, alça de Drigalski, pipetas analíticas e ponteiras). Quando completar 1 hora de incubação pegar o caldo BHI e repetir o procedimento anterior [retirar 10 µL e depositar na superfície do ágar BAB...], marcando agora esta placa como tempo UMA HORA, e incubá-la em estufa bacteriológica à 36ºC.  Incubar o caldo BHI novamente em estufa bacteriológica até completar 85 minutos.

D) Após este tempo, preparar o material necessário para o próximo processamento (ágar BAB, alça de Drigalski, pipetas analíticas e ponteiras). Quando completar uma hora e meia de incubação pegar o caldo BHI e repetir o procedimento anterior [retirar 10 µL e depositar na superfície do ágar BAB...], marcando agora esta placa como tempo UMA HORA E MEIA, e incubá-la em estufa bacteriológica à 36ºC.  Incubar o caldo BHI novamente em estufa bacteriológica por mais até completar 115 minutos.

E) Após este tempo, preparar o material necessário para o próximo processamento (ágar BAB, alça de Drigalski, pipetas analíticas e ponteiras). Quando completar duas horas de incubação pegar o caldo BHI e repetir o procedimento anterior [retirar 10 µL e depositar na superfície do ágar BAB...], marcando agora esta placa como tempo DUAS HORAS, e incubá-la em estufa bacteriológica à 36ºC.  Incubar o caldo BHI novamente em estufa bacteriológica até completar 145 minutos.

F) Após este tempo, preparar o material necessário para o próximo processamento (ágar BAB, alça de Drigalski, pipetas analíticas e ponteiras). Quando completar duas horas e meia de incubação pegar o caldo BHI e repetir o procedimento anterior [retirar 10 µL e depositar na superfície do ágar BAB...], marcando agora esta placa como tempo DUAS HORAS E MEIA, e incubá-la em estufa bacteriológica à 36ºC.  Incubar o caldo BHI novamente em estufa bacteriológica até completar 175 minutos.

Quando completar 3 horas de incubação, o número de células de E.coli já estará acima de 1000 colônias/mL. Recomenda-se então diluir 1:2 o caldo BHI antes de inocular no ágar BAB, e depois usar fator de correção para calcular o número de colônias.

No segundo dia de aula prática:

- Após incubar os meios de cultura (ágar BAB) por 24 horas à 36ºC, fazer a contagem das colônias bacterianas, e interpretar os resultados.

 Já que 10 µL corresponde a centésima parte do mL, o fator de correção para expressar o número de colônias por mL, ou unidades formadoras de colônia (UFC); é 100, ou seja, multiplica-se o número de colônias contadas por 100.

Exemplo: 45 colônias em 10 µL

                45 x 100 = 4.500 UFC/mL ou colônias/mL

Tempo	Ágar BAB (Número de colônias)	Unidades formadoras de colônias por mL
ZERO
30 minutos
1 HORA
1:30
2 HORAS
2:30
TRÊS HORAS

                                        TUTORIAL - CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO
                                    Bactéria: Escherichia coli ATCC 25922- Gravado em 16 de Setembro de 2016
                                                         Local: Laboratório de Atividade Antimicrobiana (UEPB- campus I)

Autora: Professora Zilka Nanes Lima

Clique no link para abrir o arquivo em pdf da tabela de conversão ufc g-1 - log10 ufc g-1  Tabela de conversão ufc g-1 - log10 ufc g-1

2.2  PRÁTICA 2 – Verificação por turbidez no espectrofotômetro. Em dois dias de aula (No primeiro dia o caldo BHI já estará inoculado e incubado por 24 horas à 36^oC – pré-inóculo) – O método que segue foi retirado de uma apostila de curso de férias da UFRJ.

2.1.1.     MATERIAL NECESSÁRIO:

• Erlenmeyer de 250 mL *

• Palito de dente ou swab*

• Solução fisiológica *

• Béquer *

• Tubos cônicos*

• Pipetas

• Escherichia coli

• Meio de enriquecimento líquido* (BHI)

• Espectrofotômetro

OBS: * esse material deve ser estéril

2.1.2.     PROCEDIMENTOS

          Verificação por turbidez no espectrofotômetro (figura 4)

Preparar o meio BHI líquido e o autoclavar. Colocar cerca de 5 mL do meio em um tubo cônico. Com um palito de dente, raspar um POUCO da cultura de E. coli na placa de Petri e encostar no meio de cultura do tubo cônico (pré-inóculo). Trabalhar no fluxo laminar ou na zona de segurança para evitar a contaminação por outros micro-organismos. Deixar crescer esse pré-inóculo de um dia para o outro à temperatura a ser testada, sempre em agitação. No dia seguinte, fazer uma diluição do pre-inóculo para saber a concentração de bactérias no mesmo (exemplo 50 µL de pré-inóculo + 950 µL de solução fisiológica). Antes de ler a absorbância (ABS) à 600 nm do pré-inóculo, fazer uma diluição do meio (50 µL de meio + 950 µL de água), ler essa ABS e dar auto-zero para descontá-la. Posteriormente, ler a ABS da diluição do pré-inóculo. Para começar o crescimento, o ideal é que ABS inicial no meio de crescimento esteja aproximadamente 0,1 uma vez que o método apresenta linearidade entre 0,1 e 0,4 de ABS. Logo, devo fazer o cálculo mostrado no exemplo para saber a quantidade de pré-inóculo a ser colocada no meio de crescimento.

Exemplo: ABS da diluição do pré-inóculo = 0,073

Como o pré-inóculo foi diluído 20 vezes (50µL/1000µL), então devo multiplicar por 20 a diluição do mesmo, logo ABS = 1,46 ABS/mL. Para começar o crescimento, quero utilizar 30 mL de meio, logo a conta é a seguinte:

 1,46. X = 0,1. 30

 X = 2,06 mL de pré-inóculo

2,06 mL pré-inóculo + 27,94 mL meio = 30 mL total

Antes de acrescentar o pré-inóculo no meio de crescimento, ler a ABS de 1 mL de meio puro e dar auto-zero para descontar a cor do mesmo. Logo que o pré-inóculo for acrescentado ao meio, verificar a ABS inicial, que corresponde ao tempo zero na curva de crescimento. Colocar o Erlenmeyer à temperatura controlada e em agitação contínua. Posteriormente, verificar a ABS de 30 em 30 minutos ou em outros intervalos de tempo. A faixa de ABS em que o método é linear é de 0,1 a 0,4. Por esse motivo, em tempos tardios do crescimento deverá ser feita uma diluição antes de ser verificada a ABS. Não se esqueça de multiplicar pelo valor da diluição na hora de interpretar os dados! Não se esqueça de dar auto-zero com o meio sem bactérias sempre antes de ler a alíquota em cada tempo de crescimento!!! Construir um gráfico em que o eixo X é o tempo e o Y é cada ABS (figura 3).

                   Figura 3 - Crescimento Populacional de Bactérias.

Fonte: ebah

                                  Figura 4 - Turbidimetria (espectrofotômetro)

Fonte: Wiki AIA 13-17

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Referências bibliográficas:

1.       Levinson, W. Microbiologia Médica e Imunologia. 13^a Edição. Ed. ArtMed. Porto Alegre – RS, 2016.

2.       http://ltc.nutes.ufrj.br/constructore/objetos/velocidade%20de%20divisao%20das%20bacterias.pdf Acesso em 11 de Setembro de 2016.

3.        Conhecimento adquirido.

                

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