7. GRAM

Hans Christian Joachin Gram, em 1884 desenvolveu a técnica de coloração de Gram
Fonte: https://flavioehedranbioifes.wordpress.com/

COLORAÇÃO DE GRAM
(Microbiologia Básica e Clínica / Profa . ZilkaNanes Lima)
 Copyright  ZILKA NANES LIMA © 2016 -  Todos os direitos reservados

1.Princípio : A coloração de Gra m s erve para um diagnós tico rápido pres untivo de um agente infecc ios o e també m para avaliar a qualidade da a mos tra para cultura. O Gra m c las s ifica as bactérias com bas e na morfologia e a fin idade pelos corantes em Gra m-pos itivas (ro xas ) e Gra m-negativas (ros as ).

2.Materiais clínicos que podem s er utilizados :

Amos tras recebidas em s wabs , a mos tras obtidas após as piração, frag mentos de tecido e bióps ias , líquidos orgânicos   em  geral  (líquor,   líquido  s inovial,   líquido  as cítico,  líquido  pleura l),  s ecreções   em  geral  (uretra l, vaginal,orofaringe, nas al, etc), fe zes  e a mos tras de urina.

PS: O Gra m ta mbé m pode s er realizado a partir do cres ci mento de mic ro-organis mos e m me ios s ólidos ou líquidos .

3.Procedimento:

3.1  Preparo do es fregaço para Gram:

- Es fregaços de colônias : Colocar u ma pequena gota de s olução fis iológica s obre a lâ mina, co m u ma a lça ou fio bacteriológico, tocar na s uperfíc ie de u ma co lônia is olada e e muls ionar gentilmente na gota colocada s obre a lâ mina. Deixar s ecar ao ar e fixar no calor brando.

-Esfregaços provenientes de meios de cultura líquidos: Transferir uma amostra com alça bacteriológica para uma lâmina. Deixar secar ao ar e fixar pelo calor brando. 

- Amostras recebidas em “Swabs ” –  Rolar o swab delicada mente s obre a superfície de u ma lâmina limpa . Deixar s ecar ao ar e fixa r no calor brando.

-Amostras de urina: 
       1. Urina de jato médio: 
                           - Homogeneizar o material e depositar 10 μL em uma lâmina, sem espalhar.
                           - Deixar secar ao ar e fixar no calor.
       2. Urina de 1º jato: 
                          -Centrifugar 1.500 rpm/5 min.  
                          -Retirar o sobrenadante e colocar uma gota do sedimento em uma lâmina demarcada, sem espalhar.
                          - Deixar secar ao ar e fixar pelo calor brando. 

- A mos tras  que requerem centrifugação  (Ex: líquor, líquuido ascítico, líquido pleural etc.): De ma rar a á rea na lâ mina na qual o  mate ria l s erá depositado , homogeneizar o s edimento e es palhar na área. Para aumentar a concentração colocar u ma segunda gota na mesma área . Deixar s ecar ao ar e fixar no calor.

- A mos tras  de aspirado, e xs udatos , es carro e fezes : Se co m pouca vis cos idade, homogeneizar  e fa ze r o esfregaço. Se es pes sa, dilu ir e m s olução fisiológ ica es téril antes . Deixar s ecar ao ar e fixar no ca lor.

Figura 1 - Esquema de confecção do esfregaço a ser corado pelo Gram.

Fonte: Autora (arquivo pessoal)

3.2  Co loração de Gra m:

1.     Confeccionar o es fregaço, fixar o es fregaço na chama do bico de Buns en;

2.    Dis por as lâ minas em u m s uporte não muito pró ximo u ma de outra;

3.    Cobrir o es fregaço co m papel de filtro (modificação da autora);

4.    Cobrir o papel de filtro co m cris tal violeta e de ixa r por 1 minuto;

5.    Lavar co m água corrente, retirando o papel de filtro e o e xces s o do corante;

6.    Cobrir o es fregaço co m Lugol fraco por 1 minuto;

7.    Lavar co m água corrente;

8.     Desc orar com álcool-acetona, prime iro cobrindo o es fregaço deitado no s uporte durante 5 segundos , e depois gotejando   a lâmina inclinada até que não es corra mais o cris tal violeta (cuidado para não descorar demais ). PS: Pode s e utilizar apenas álcool a 95% .

9.    Lavar co m água corrente;

10.  Cobrir co m fucsina ou safranina por 30 segundos diluidas  1/10 (s e o corante for novo deixa r u m tempo ainda menor)

11.  Lavar co m água corrente;

12.  Caso o verso da lâmina (o lado que não está com o esfregaço) ainda esteja sujo de corantes, passar um papel absorvente com descorante;

13. Deixar a lâmina em pé em uma estante, ou encostada na parede encima da bancada, para secar ao ar;

14.  Exa minar ao mic ros cópio.

Figura 2 - Esquema da coloração de Gram.

Fonte: ebah

                                                       Figura 3 - Passo a passo da Coloração de Gram.

Fonte: Autora (arquivo pessoal)

                                                                Vídeo: Técnica de coloração de Gram

                                                     Fonte: https://www.youtube.com/watch?v=0zq9ra_YUGQ

Figura 4 - Bactérias Gram-positivas se coram em roxo e bactérias Gram-negativas se coram em rosa. 

Fonte: http://www.farmaceuticacuriosa.com/2015/03/coloracao-de-gram.html

                                                               

4. Co mo reportar o res ultado:

GRAM : Em alguns materia is clínicos é importante avaliar s ua qualidade. Co m objetiva de 10x ava lia r a qualidade do materia l c línico e es fregaço, verificando pres ença de leucócitos e células epitelia is . Co m objet iva de imers ão de 100x (au mento de 1.000x), analis ar várias áreas do es fregaço e re latar a aus ência ou pres ença de micro-organismos , quantificando segundo a tabela 1 e c las s ificando conforme des crito a s eguir:

Des crição da morfologia e agrupa mento dos mic ro -organis mos obs ervados :

-Cocos Gra m-pos itivos aos pares

-Cocos Gra m-pos itivos em cadeias

-Cocos Gra m- pos itivos agrupados

-Bas tonetes ou Bacilos Gra m-pos itivos

- Bas tonetes ou Bacilos Gra m-pos itivos ramificados

-Bas tonetes ou Bacilos Gra m-pos itivos corineifo rmes ou difteróides

-Bac ilos gram-pos itivos tipo Döderlein

-Diplocococos Gra m-negativos

-Bas tonetes ou Bacilos Gra m-negativos

-Cocobacilos Gra m-negativos

-Cocobacilos Gra m-variáveis

-Leveduras e/ou leveduras em brota mento e/ou com fo rmação de pseudohifas .

                Tabela 1 – Orientação simplificada para a leitura das lâminas coradas pelo método de Gram 
                                                                               (s uges tão de quantificação)

Clas s ificaão numérica	Class ificação desscritiva	Média do número de bactérias /10 ca mpos observados com au mento de 1.000x
0	Aus entes	0
1+	Raros	1-5
2+	Alguns ou poucos	6-15
3+	Frequentes	16-30
4+	Nu meros os	>30

        Fonte: Oplustil et.al., 2004

                  Em alguns casos é importante reportar também no resultado a celularidade, por exemplo, em materiais normalmente estéreis, amostras do trato respiratório inferior e amostras do trato genital.

5.Comentários : Para v is ualizar micro -organis mos pelo método de Gra m,em amostras de urina em gera l é necessária a presença de cerca de 104UFC/ mL (ou col/ mL) .


- Limite de detecção para amostras de urina segundo a ANVISA;       ≥ 1 bactéria em campo de imersão
                                                                                                                                 ≥ 10⁵ UFC/ml

                  Um res ultado negativo não s ignifica obrigatoriamente aus ência de mic ro -organis mos naquela a mos tra e deve s er confirmado co m a cultura. Lembrar que se não houver crescimento na cultura não significa obrigatoriamente ausência de micro-organismos em determinado material clínico. 

          Figura 5a - Esfregaço confeccionado a partir do líquor oriundo de uma paciente de 61 anos com           sintomatologia de meningite bacteriana; e corado pela técnica de Gram.   

Em objetiva de imersão (100x), observamos diplococos Gram-negativos, sugestivos de Neisseria spp.

Fonte: contribuição da Biomédica Niedja Eloi (2016)

       Figura 5a - Esfregaço confeccionado a partir do líquor oriundo de uma paciente de 61 anos com           sintomatologia de meningite bacteriana; e corado pela técnica de Gram.   Em objetiva de imersão (100x); observamos diplococos Gram-negativos, intracelulares e intracelulares sugestivos de Neisseria spp.

Fonte: contribuição da Biomédica Niedja Eloi (2016)

6. Manuseio do microscópio óptico para leitura de esfregaços corados pelo Gram:

     6.1 Selecionar a objetiva de 10x e baixar completamente a platina;

     6.2 Colocar a lâmina sobre a platina e prendê-la corretamente; verificar a intesidade da luz e, se necessário, ajustar;

     6.3 Iniciar a observação com a objetiva de 10x;

     6.4 Para focalizar:
           - Realizar os primeiros movimentos com o micrométrico.
           - Assim que conseguir encontrar o foco, colocar uma gota de óleo de imersão e passar para a objetiva de 100x.
          - Utilizar agora o micrométrico até conseguir a focalização desejada. Aumentar ou diminuir a intensidade da luz para melhorar a visualização das estruturas.

     6.5 Após utilizar a objetiva com óleo de imersão, limpá-la com panos especiais para lentes, como papel de óptica ou papel de filtro, passando o papel suavemente somente em um sentido. Caso o óleo de imersão seque na objetiva, limpar com álcool:acetona (7:3) ou xilol. Não utilizar solventes excessivamente, pois podem danificar as lentes. 
    

Referências: 

- Módulo 1 da Anvisa (Agência Nacional de Vigilânica Sanitária):  Principais Sídromes Infecciosas. 
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_1_2004.pdf Acesso em 25 de Setembro de 2016.

- Oplus til, C.P.; Zoccoli, C.M.; Tobouti, N.R.; Sinto, S.I. Proce di mentos Bás icos em Micr obiol ogia Clínica, 
    Ed. Sarvier, 3ª edição. São Paulo, SP, 2010.

- Oplus til, C.P.; Zoccoli, C.M.; Tobouti, N.R.; Sinto, S.I. Proce di mentos Bás icos em Micr obiol ogia Clínica, 
    Ed. Sarv ier, 2ª edição. São Paulo, SP, 2004.


- http://www.kasvi.com.br/uso-limpeza-microscopio-optico/ Acesso em 06 de Setembro de 2016.

-Conhecimento adquirido.

                 

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