2.LEVEDURAS

Fonte: http://www.infoescola.com/reino-fungi/levedura/

MICOLOGIA  (Parte 1 – Prática de Fungos leveduriformes)

(Microbiologia Básica / Profa . ZilkaNanes Lima)

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1.     INTRODUÇÃO

            Durante muitos anos a Micologia teve pouca expressão na área médica, possivelmente pela falta de diagnóstico adequado. Ultimamente, o número de pacientes suscetíveis aos mais variados tipos de infecções tem aumentado significantemente. Com esse crescimento, as infecções fúngicas vêm se tornando mais freqüentes.

Com o aparecimento da antibioticoterapia, utilização de métodos imunossupressores, surgimento da AIDS e melhora nos métodos diagnósticos observamos aumento no número de casos de infecções fúngicas.

O diagnóstico de uma infecção fúngica tem por base a combinação de dados clínicos e laboratoriais. O processo laboratorial inclui: - demonstração do fungo no material examinado por microscopia e cultura, - detecção de anticorpos específicos e detecção de antígenos e metabólitos liberados pelo fungo nos líquidos corpóreos ou tecidos.

Tendo em vista a importância do diagnóstico micológico, a disciplina objetiva desenvolver no aluno a capacidade de identificação de fungos filamentosos e leveduriformes assim como introduzir os principais aspectos da Micologia Médica. Portanto, torna-se imprescindível o bom conhecimento das principais estruturas fúngicas e das técnicas utilizadas em sua identificação.

As micoses podem ser divididas em:

·        Superficiais:

· Pitiríase versicolor

· Piedra branca

· Piedra negra

·        Cutâneas:

· Dermatofitoses

· Candidíase

·        Subcutâneas:

· Cromomicose,

· Esporotricose

· Micetoma (eumicetoma e actinomicetoma)

· Zigomicose

· Rinosporidiose

· Doença de Jorge Lobo

· Feo-hifomicose

· Hialo-hifomicose

·        Sistêmicas:

· Paracoccidioidomicose

· Histoplasmose

·        Oportunistas:

· Criptococose

· Aspergilose

2. Identificação de Candida spp.

2.1. Candidíases (Monilíases):

São os nomes de conotações genéricas para denominar doenças causadas por Candida albicans e outras espécies. O habitat da Candida é bastante amplo,no homem essa levedura habita a mucosa digestiva e por contigüidade a mucosa vaginal. A infecção pode atingir mucosas, tecido cutâneo e em alguns casos pode ser sistêmica. As manifestações clínicas apresentam grande diversidade de quadros, podendo ser divididas em três grandes grupos: Candidíase cutâneo-mucosa, Candidíase sistêmica e candidíase alérgica. As principais espécies patogênicas são: C. albicans, C. tropicalis, C. pseudotropicalis, C. guilliermondi, C. parapsilosis, C. krusei

2.2.- PROVA DO TUBO GERMINATIVO:

A prova do tubo germinativo é um teste que caracteriza rápida e presuntivamente a levedura da espécie Candida albicans.  A técnica é muito simples e baseia-se, fundamentalmente, na semeadura de um pequeno inóculo dessa levedura em soro, que pode ser de várias espécies animais. Os soros recomendados são o humano, o fetal bovino ou de cavalo, podendo-se, ainda, utilizar albumina de ovo.

Técnica: a.) Com a ponta de uma pipeta Pasteur estéril, ou ainda, com uma alça de platina calibrada (0,001ml), retirar uma pequena porção de uma colônia de levedura e emulsioná-la de forma asséptica em 0,5 ml de soro. Evitar, se possível, o uso de soro humano, que pode ter anticorpos ou ainda antifúngicos. 

b.) Incubar a 37º C por um período de 1,5-2 horas, em banho-maria, ou até 3 horas em estufa bacteriológica.

c.) Findo este período, deve-se remover uma gota da suspensão e montar uma preparação do tipo lâmina-lamínula, para observação microscópica. O tubo germinativo, quando o teste for positivo, aparecerá como filamento fino e cilíndrico, originado do blastoconídio da levedura, no qual não se observa nenhuma zona de constricção, quer na base ou ao longo de sua extensão.

2.3.- MICROCULTIVO DE LEVEDURAS

Esta técnica baseia-se no princípio de que leveduras, quando incubadas num meio com Tween-80 apresentam a capacidade de filamentar, formando pseudo-hifas e/ou hifas verdadeiras. Assim, pelas características morfológicas diferenciadas das estruturas filamentosas, pode-se sugerir a espécie de levedura implicada na identificação.

2.4.-  CHROMagar Candida Medium

2.4.1. UTILIZAÇÃO PRETENDIDA : CHROMagar Candida Medium é um meio de isolamento e identificação para Candida albicans, C. tropicalis e C. krusei de amostras clínicas. Possui uma ação inibidora para as bactérias e também pode ser utilizado como meio de isolamento seletivo para outras espécies de leveduras e para fungos filamentosos.

2.4.2. PRINCÍPIOS E EXPLICAÇÃO DO PROCEDIMENTO

(Método microbiológico) O CHROMagar Candida Medium é um meio selectivo para diferenciação utilizado para o isolamento de fungos. Com a inclusão de substratos cromogênicos no meio, as colônias de C. albicans, C. tropicalis e C. krusei produzem cores diferentes, permitindo assim a detecção direta destas espécies de leveduras na placa de isolamento. As colônias de C. albicans aparecem com uma cor verde-claro a verde médio, as de C. tropicalis aparecem azuis esverdeadas a azul metalizado e as de C. krusei aparecem cor-de-rosa claro com um rebordo esbranquiçado. Outras espécies de leveduras poderão desenvolver a sua cor natural (creme) ou aparecer cor-de-rosa ou cor de malva claro a escuro [por exemplo Candida (Torulopsis) glabrata e outras espécies]. Uma vantagem adicional deste meio consiste é a fácil detecção de culturas mistas de leveduras devido à apresentação das suas colônias com cores diferentes. As peptonas especialmente selecionadas para o efeito fornecem os nutrientes no CHROMagar Candida Medium. A mistura exclusiva de cromogênios é composta por substratos artificiais (cromogênios), que libertam compostos de várias cores na sequência da degradação de enzimas específicas. Tal permite a diferenciação de determinadas espécies, ou a detecção de determinados grupos de organismos, utilizando apenas um número mínimo de testes de confirmação. O cloranfenicol presente no meio inibe a maioria dos contaminantes bacterianos.

2.4.3. PROCEDIMENTO DO TESTE

Espalhar a amostra para isolamento sobre a superfície do meio. Se a amostra estiver a ser cultivada a partir de uma zaragatoa, fazer rolar suavemente a zaragatoa sobre uma pequena área da superfície na extremidade e, em seguida, espalhar a partir desta área com um alça. Incubar as placas em condições aeróbias, a uma temperatura de 35 ± 2°C, durante 20 a 48 h numa posição invertida. É necessário um período de incubação de 42 h para o desenvolvimento completo da cor das colônias de Candida. Minimizar a exposição à luz antes e durante a incubação.

Os isolados ocasionais, como é o caso de Cryptococcus neoformans e dos fungos filamentosos, irão necessitar de um período de incubação mais longo e, possivelmente, uma temperatura de incubação mais baixa para se desenvolverem bem. Por essa razão, deve inocular-se e incubar-se uma placa contendo um segundo meio fúngico, por exemplo BD Sabouraud Agar with Gentamicin and Chloramphenicol a uma temperatura entre 20 e 25°C, caso se preveja a existência de outros fungos que não os da espécie Candida.

 2.4.4. RESULTADOS

Após a incubação, as placas provenientes das amostras que contêm fungos apresentarão indícios de crescimento. Recomenda-se a leitura das placas sobre um fundo branco. Se estiverem presentes espécies de Candida, as colônias irão se apresentar-se com  uma cor verde-claro a verde-médio (Candida albicans), cor-de-rosa claro a vermelho claro com rebordo esbranquiçado (C. krusei), ou azuis esverdeadas a azul metalizados com ou sem halos violetas (C. tropicalis). O restante das espécies de Candida e outro tipo de leveduras aparecerão com uma cor de malva claro a escuro (rosa a violeta) ou, no casos em que não é utilizado nenhum dos substratos cromogênicos, irão apresentar a sua cor natural das colônias (creme a branco).  Os dados dos vários estudos realizados indicam que não são necessários mais testes de identificação relativamente às espécies Candida albicans, C. tropicalis e C. krusei.

   Professora Zilka Nanes Lima (Microbiologia e Imunologia Clínica)

    MICROBIOLOGIA BÁSICA

Fontes: Apostila de Micologia Clínica (Professor Sandro Rogério de Almeida – Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo) e http://www.bd.com/resource.aspx?IDX=9113

                          

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