Bacterioscopia / GRAM

 

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1.Princípio:

A coloração de Gram serve para um diagnóstico rápido presuntivo de um agente

infeccioso e também  para avaliar a qualidade da amostra para cultura.

O Gram classifica as bactérias com base na morfologia e afinidade  pelos corantes em

Gram-positivas (roxas) e Gram-negativas (rosas). 

2.Materiais clínicos que podem ser utilizados:  Amostras recebidas em swabs, amostras obtidas após aspiração, fragmentos de tecido e biópsias, líquidos  orgânicos em geral (líquor, líquido sinovial, líquido ascítico, líquido pleural), secreções em geral (uretral,  vaginal,orofaringe, nasal, etc), fezes e amostras de urina.   PS: O Gram também pode ser realizado a partir do crescimento de micro-organismos em meios sólidos ou líquidos.

3.Procedimento:  

 3.1 Preparo do esfregaço para Gram: 

- “Swabs” – Rolar o swab delicadamente sobre a superfície de uma lâmina limpa. Deixar secar ao ar e fixar  no calor. 

- Amostras que requerem centrifugação (Ex: urina): Demarcar a área na lâmina na qual o material será  depositado , homogeneizar o sedimento e espalhar na área. Para aumentar a concentração colocar uma segunda gota  na mes ma área. Deixar secar ao ar e fixar no calor. 

- Amostras de aspirado, exsudatos, escarro e fezes: Se com pouca viscosidade, homogeneizar e fazer o  esfregaço. Se espessa, diluir em solução fisiológica estéril antes. Deixar secar ao ar e fixar no calor. 

Esfregaços de colônias: Colocar uma pequena gota de solução fisiológica sobre a lâmina, com uma alça ou fio  bacteriológico, tocar na superfície de uma colônia isolada e emulsionar gentilmente na gota colocada sobre a lâmina.  Deixar secar ao ar e fixar no calor. 

3.2 Coloração de Gram: 

1. Confeccionar o esfregaço, fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen; 

2. Dispor as lâminas em um suporte não muito próximo uma de outra; 

3. Cobrir o esfregaço com papel de filtro; 

4. Cobrir o papel de filtro com cristal violeta e deixar por 1 minuto; 

5. Lavar com água corrente, retirando o papel de filtro e o excesso do corante; 

6. Cobrir o esfregaço com Lugol fraco por 1 minuto; 

7. Lavar com água corrente; 

8. Descorar com álcool-acetona, primeiro cobrindo o esfregaço deitado no suporte durante 10-20 segundos, e  depois gotejando a lâmina inclinada até que não escorra mais o cristal violeta (cuidado para não descorar  demais). PS: Pode se utilizar apenas álcool a 95% ou acetona; 

9. Lavar com água corrente; 

10. Cobrir com fucsina ou safranina por 30 segundos diluidas 1/10 (se o corante foi novo deixar um te mpo  ainda menor) 

11. Lavar com água corrente e secar ao ar ou com papel de filtro; 

12. Examinar ao microscópio.

4. Como reportar o resultado: 

GRAM: Em alguns materiais clínicos é importante avaliar sua qualidade. Com objetiva de 10x avaliar a qualidade  do material clínico e esfregaço, verificando presença de leucócitos e células epiteliais. Com objetiva de imersão de  100x (aumento de 1.000x), analisar várias áreas do esfregaço e relatar a ausência ou presença de micro -organis mos,  quantificando segundo a tabela abaixo e classificando conforme descrito a seguir: 

Descrição da morfologia e agrupamento dos micro-organismos observados: 

-Cocos Gram-positivos aos pares 

-Cocos Gram-positivos em cadeias 

-Cocos Gram- positivos agrupados 

-Bastonetes ou Bacilos Gram-positivos 

-Bastonetes ou Bacilos Gram-positivos ramificados 

-Bastonetes ou Bacilos Gram-positivos corineiformes ou difteróides 

-Bacilos gram-positivos tipo Döderlein 

-Diplocococos Gram-negativos 

-Bastonetes ou Bacilos Gram-negativos 

-Cocobacilos Gram-negativos 

-Cocobacilos Gram-variáveis 

- Leveduras e/ou leveduras em brotamento e/ou com formação de pseudohifas.

  Tabela – Orientação para a leitura da coloração pelo método de Gram (sugestão de quantificação) 

Classificação numérica	Classificação descritiva	Média do número de bactérias/10 campos  observados com aumento de 1.000x
0	Ausentes	0
1+	Raros	1-5
2+	Alguns ou poucos	6-15
3+	Frequentes	16-30
4+	Numerosos	>30

5. Comentários: Para visualizar microrganismos pelo método de Gram, em geral é necessária a presença de cerca  de 104UFC/mL (ou col/mL).  

Um resultado negativo não significa obrigatoriamente ausência de micro-organismos naquela amostra e deve ser  confirmado com cultura. 

Referências:  

1. Oplustil, C.P.; Zoccoli, C.M.; Tobouti, N.R.; Sinto, S.I. Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica,  3.ed. Editora Sarvier, São Paulo, SP, 2010. 

2. Conhecimento adquirido.